چکیده :

چکیده : باکتری E.coliO157H7  یکی از عوامل اصلی ایجاد کننده مسمومیت غذایی و بیماری هایی مانند : اسهال، کولیت خونریزی دهنده، سندرم اورمیک همولتیک، پورپورای ترمبو سیتوپنیک و حتی مرگ در انسان است. هدف این پژوهش ارزیابی ژن‌های بیماری زای 1stx, 2stx, eaeA در نمونه های ادراری شهرستان الشتر می باشد.

روش کار: در این پژوهش 100 نمونه عفونت ادراری از سه بیمارستان شهرستان الشتر به مدت 6 ماه جمع آوری شد و پس از کشت روی محیط های اختصاصی با استفاده از روش Multiplex PCR وجود ژن های 1stx, 2stx, eaeA مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج : از 100 نمونه عفونت ادراری مورد ارزیابی، تعداد 2 جدایه با درصد فراوانی(2%) دارای ژن های 2stx, eaeA بودند. یک جدایه (1%) دارای ژن 2stx  بود و هیچ نمونه ای با هر سه ژن مشاهده نشد.

نتیجه گیری: از آنجایی که اشریشیا کلی 7H:157O یکی از نگرانی های اساسی بهداشت و سلامت انسان محسوب می شود . بایستی مورد توجه دائمی قرار گیرد. راه های پیشگیری می تواند موجب کاهش آلودگی به این باکتری شود.

کلمات کلیدی : اشریشیا کلی 7H157O _ژن های شیگا توکسین _ عفونت ادراری.

مقدمه :             

عفونت های مجاری ادراری (Urinary Tract Infections) از شایع ترین بیماری های عفونی در تمام دوران زندگی و از علل شایع مراجعات پزشکی می باشد. این عفونت ها از نظر فراوانی بعد از بیماری های تنفسی قرار دارند و یکی از عمده ترین عفونت های باکتریایی در کشور های صنعتی و در حال توسعه محسوب می شوند (11). UTI از جمله مشکلات حادی است که سالانه میلیون ها انسان با آن روبرو هستند و در تمام دوران زندگی در هر دو جنس مرد و زن بروز می کند. هر ساله بین 8 تا 10 میلیون مراجعه به پزشک به علت عفونت های ادراری می باشد (14). عفونت هاي مجاري ادراري علاوه بر آنکه خود به خود و به تنهایی بیماری آزار دهنده ای است گاهی سبب بروز بیماری های دیگری نیز خواهد شد. مثلاً برخی از عفونت های دستگاه ادراری می توانند گاهی باعث از کار افتادگی کلیه ها شوند و یا عفونت کلیوی در خون پخش شده و سپس در تمام بدن گسترش یابند. یا برخی عفونت ها ممکن است به ایجاد سنگ کلیه در بیماران منتهی شوند که همه این ها نشان دهنده اهمیت شناسایی، بررسی میزان شیوع و درمان این بیماری است (15). راهکارهای مرتبط با تشخیص، درمان و پیگیری عفونت های ادراری روز به روز در حال تغییر هستند. لذا می بایست رویکرد هایی کارآمد و با پیچیدگی نسبتاً کمتر برای این ارزیابی ها توصیه شود و بسیار مهم خواهد بود که پزشکان خانواده قادر به تشخیص به موقع و درمان مناسب عفونت های ادراری در بیماران باشند. بیش از 90 درصد موارد عفونت های ادراری توسط باکتری ها ایجاد می شود و در بقیه موارد ویروس ها، انگل ها و قارچ ها دخیل خواهند بود. شایع ترین عوامل عفونت ادراری اعضای خانواده انتروباکتریاسه علی الخصوص اشرشیا کلی و در رتبه های بعدی انتروباکتر، سراشیا، کلبسیلا و پروتئوس می باشند. انواعی از کوکسی های گرم مثبت نیز در بروز این نوع عفونت نقش قابل ملاحظه ای خواهند داشت (14). بررسی های اپیدمیولوژیک نشان داده است که عفونت ادراری به سنین خاصی محدود نشده بلکه در تمام گروه های سنی از جمله در نوزادان، کودکان و بزرگسالان مشاهده می شود (15). اشرشیا کلی شاخص ترین عامل باکتریال عفونت های ادراری محسوب می شوند. قابلیت بیش از 150 سویه E.coliO157:H7 ( (E. coli جهت کلونیزاسیون در پرینه و مجاری ادراری و یا مهاجرت آن به دستگاه ادراری به دلیل وجود فاکتور های ویرولانس خاص در این سویه ها است.  E. coli دارای 4 تیپ مهم بالینی است که عبارتند از انتروتوکسیژنیک (ETEC)،انتروپاتوژنیک (EPEC)، انترو این وی زیو (EIEC) و انتروهموراژیک (EHEC). تیپ انتروهموراژیک که به دلیل ترشح نوعی توکسین، تحت عنوان اشرشیا کلی وروتوکسیژنیک (VTEC) نیز نامیده می شود از عوامل مهم سندروم های خون ریزی دهنده و همولیتیک و همچنین نارسایی های کلیوی متعاقب آن بوده که می تواند در مجاری ادراری و دستگاه گوارشی مشکل ساز باشد. سویه O157:H7 اشرشیا کلی مهم ترين سروتيپ سويه هاي انتروهموراژيك است كه به عنوان یکی از عمده ترین سویه های بیماری زای انسان معرفی شده و سالانه بروز چندین مورد مرگ و میر از طریق ایجاد عفونت های حاد، خصوصاً با مصرف مواد غذایی آلوده و یا تماس با منابع آلوده را سبب می گردد. همانطور که اشاره شد، سويه هاي اشرشيا کلي انتروهموراژیک توکسینی ترشح می کنند که به دليل توانايي آن در کشتن سلولهاي vero، وروتوکسين و به دليل شباهتش به نوروتوکسين مترشحه از شیگلا دیسانتری تیپ I، توکسين شبه شيگا (SLT) نامیده می شود و سويه هاي توليد کننده آن به STEC  نیز معروفند (13). ژن تولید کننده وروتوکسين برروي ژنوم باکتريوفاژ معتدل قرار داشته و توسط تبديل فاژي به اشرشيا کلي وارد مي گردد (13). توکسين هاي ورو به دو گروه stx1 و stx2 تقسيم بندي مي شوند. وروتوکسين با اثر بر روی RNA  ريبوزومي سبب ممانعت از سنتز پروتئين ها شده و انواعي از اشرشيا کلي که اين سم را توليد مي کنند موجب بروز سندروم هاي خطرناکي از جمله کوليت هموراژيک (HC)، سندروم اورمی همولیتیک (HUS) و به دنبال آن نارسايي های کليوي خصوصاً در سنین پایین می گردد (17، 18 و 19). شناسایی اين سويه ها به دلیل پیچیده بودن، معمولاً به صورت روتين در آزمايشگاه ها انجام نمي پذیرد و پژوهشگران درصدد يافتن روش هاي ساده براي غربالگري اين باکتري ها هستند. از این رو در این مطالعه سعی می شود تا با بررسی های توصیفی – مقطعی، پس از انجام روش های کلاسیک شناسایی و تشخیص باکتری اشرشیا کلی O157:H7، با به کار گیری روش های مولکولی، ضمن تأیید نتایج حاصله در تشخیص، متد های سریع تر و با دقت و حساسیت بالاتر نیز معرفی و ارائه گردد.   

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه

مقدمه  ..................................................................................................................................................................   1

اهداف اصلی طرح  ..............................................................................................................................................   3

اهداف اختصاصی طرح  .......................................................................................................................................   3

اهداف کاربردی طرح  ..........................................................................................................................................   3

فرضیات یا سئوالات پژوهشی  ............................................................................................................................   4

فصل اول بررسی متون ( کلیات)  ........................................................................................................................   5

1-1 تاریخچه   History )  ).............................................................................................................................   6

2-1 طبقه بندي  classification))  .................................................................................................................   6

3- 1زيستگاه (Habitat)  ..................................................................................................................................   7

4- 1 شکل باکتری ..............................................................................................................................................   7

5-1 كشت صفات بيوشيميابي..............................................................................................................................   7

6-1 مخازن و راه های انتقال باکتری  .................................................................................................................   8

7-1 ساختمان آنتی ژنی  .....................................................................................................................................   9

8-1 عوامل ویرولانس  ......................................................................................................................................... 11 

1_9انواع اشریشیاکلی .......................................................................................................................................... 12

10_1 باکتری اشرشیاکلی O157:H7...................................................................................... 14

ژن ها و عوامل حدت .......................................................................................................................................... 18

1_11زیستگاه طبیعی اشرشیاکلی O157:H7...........................................................................  19

1_12تشخیص .....................................................................................................................................................19

13_1 اپیدمیولوژی .............................................................................................................................................. 20

14-1 انتقال ........................................................................................................................................................ 21

15-1 علائم و نشانه ها ...................................................................................................................................... 22

16-1 تضاهرات بالینی ....................................................................................................................................... 22

17-1 درمان ...................................................................................................................................................... 24

18-1 پیشگیری ................................................................................................................................................   25

آشپزی و رژیم غذایی .......................................................................................................................................   26

فصل دوم مروري بر مطالعات گذشته  ..........................................................................................................     27

فصل سوم مواد و روش‌ها  ............................................................................................................................     32

1-3مواد و روش كار  ....................................................................................................................................     33

1-1-3 مواد  ..................................................................................................................................................     33

1-1-1-3محيط هاي كشت  ..........................................................................................................................     33

2-1-1-3 -ساير تركيبات  .............................................................................................................................    33

2-1-3 –وسايل  ..............................................................................................................................................   34

2-3- جامعه آماري  .........................................................................................................................................   34

3-3- حجم نمونه  ............................................................................................................................................   34

4-3- نحوة جمع‌آوري نمونه  ...........................................................................................................................   34

5-3- كشت نمونه‌ها  ......................................................................................................................................    35

6-3- تشخيص آزمايشگاهي  ............................................................................................................................  35

1-6-3- رنگ آميزي گرم  ................................................................................................................................  35

2-6-3- تست اكسيداز  ....................................................................................................................................  35

3-6-3- تست كاتالاز  .......................................................................................................................................35

4-6-3- تست هاي بيوشيميايي  ....................................................................................................................... 35

1-4-6-3-آزمايش استفـاده از سيـتـرات  ........................................................................................................36

2 -4-6-3- آزمايش تحرك و توليد اندول  ......................................................................................................36

3-4-6-3- آزمايش متيل رد (MR )  .............................................................................................................. 37

4-4-6-3- آزمايش Voges Proskauer ( VP )  ......................................................................................37

5-4-6-3-آزمايش TSI (  Triple Suger Iron Agar )  ......................................................................... 37

8-3-  نگهداري سويه ها  ................................................................................................................................. 37

9-3-آماده سازي باكتري جهت استخراج DNA  .......................................................................................... 38

1-9-3-  تـهـيه مـحيـط كشت مايع لـوريا ( LB, Luria broth )................................................................38

2-9-3- كـشـت باكـتريها بر روي محـيط LB    ......................................................................................... 38

10-3- اسـتـخـراج DNA به روش كيتBIONEER  ..............................................................................38

2-12-3- مـراحل استـخـراج DNA به روش كيت BIONEER ...............................................................39

11-3- واكنش زنجیره پلیمرازی ( ( PCR  ....................................................................................................40

مـواد لازم بـراي PCR

1-13-3 -  PCR با استـفاده از اين پرايـمرها انـجام شد  ............................................................................41

2-13-3- آماده سازي پرايمرها  ......................................................................................................................42

3-13-3- اجزای واکنش PCR  ....................................................................................................................42

4-13-3- نحوه انجام  واكنش PCR   ...........................................................................................................43

5-13-3- آماده سازي مخـلوط اصلي ( Master mix )  براي واكـنـش  PCR  .........................................43

12-3- الكتـروفـورز   ......................................................................................................................................44

1-12-3- مواد مورد نياز براي ساخت ژل آگاروز  ...............................................................................................45

2-12-3-تهیه بافر تانک الکتروفورز  ................................................................................................................45

3-12-3- روش تهيه ژل آگاروز   ....................................................................................................................45

4-12-3 طـريـقه رنگ آميـزي ژل  .................................................................................................................. 46

13-3- عـكسبـرداري از ژل  ...........................................................................................................................47

فصل چهارم نتايج  ............................................................................................................................................ 48

1-4- نتايج كشت و تعيين هويت ايزوله‌هاي كلينيكي........................................................................................49

2-4-نتایج بررسی های ملکولی PCR حاصل از ژن های 1stx ،2stx ، eaeA..............................................51

فصل پنجم بحث و پيشنهادات  .........................................................................................................................54

منابع  ................................................................................................................................................................. 60

فهرست جداول

جدول 1-4 فراوانی عوامل ایجاد کننده عفونت ادراری........................................................................................50

جدول 2-4 فراوانی ژن های 1stx, 2stx, eaeA................................................................................................ 52

فهرست نمودار

نمودار 1-4 فراوانی باکتری های ایجاد کننده عفونت ادراری در شهرستان الشتر. ..............................................51

فهرست اشکال

شکل1_1 ساختار باکتری اشریشیا کلی.................................................................................................................   6

شکل 2-1 کلنی اشریشیا کلی روی محیط EMB.................................................................................................  8

شکل 3-1 مواد غذایی که امکان وجود 7H:167O در آن زیاد است.....................................................................  9

شکل 4-1 انواع آنتی ژن در اشریشیا کلی. .............................................................................................................10

شکل 5-1 اشریشیاکلی7H:167O با بزرگنمایی 6836...........................................................................................14

شکل 6_1 ساختار توکسین شبه شیگا از اشریشیاکلی7H:167O. .........................................................................16

شکل 7_1آنمی همولیتیک وکاهش تعداد پلاکت در HUS. ................................................................................16

شکل 8_1 نارسایی حاد کلیه در HUS. ...............................................................................................................17

شکل 9_1عوارض دیررس بیماری HUS.............................................................................................................18

شکل 10_1 نقشه موارد آلودگی به اشریشیاکلی7H:167O..................................................................................22

شکل11_1 خلاصه سیر بالینی اشریشیاکلی7H:167O...........................................................................................23

شکل1_4 عکس ژل پس از الکتروفورز............................................................... ..........................................52 شکل2_4 عکس ژل پس از الکتروفورز.................................................................................................................53