چکیده:

مقدمه و اهداف

آلفا آمیلاز آنزیمی از راسته هیدرولازها است  که پیوندهای 1به4 آلفا گلیکوزیدی در پلی ساکاریدها را کاتالیز می کند و یکی از مهمترین آنزیم های گوارشی است. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز (مانند چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و  سندرم متابولیک  کمک نماید.

مواد و روش ها

موش ماده NMRI (6 هفته ای) به طور تصادفی به 4 گروه (8=n)تقسیم شدند. گروه اول  موش های نرمال بودند که تحت هیچ تیماری قرار نگرفته بودند. گروه دوم  موش های نرمال بودند که عصاره ی آبی الکلی چای سبز (به میزان 2/0 میلی گرم) مصرف کرده بودند. گروه سوم موش هایی بودند که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند وگروه چهارم موش هایی بودند که علاوه بر این که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند در این مدت از عصاره ی آبی الکلی چای سبز هم (به میزان 2/0 میلی گرم) دریافت کرده بودند. طی  8 هفته، در 4 گروه وزن بدن به صورت هفتگی اندازه گیری شدو پس از پایان دوره بافت کبدی جدا شده و بیان آلفا آمیلاز کبدی اندازه گیری شد. پس ازجداسازی RNA و سنتزcDNA،Real time -PCR با پرایمر اختصاصی برای ژن  Amy-1 ژن انجام شد.

نتایج

متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی در مقایسه با موش های کنترل عادی  افزایش یافته، و این افزایش از لحاظ آماری معنی دار است (P value≤0.01).همچنین متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق تیمار در مقایسه موش های چاق عادی کاهش یافته، واین کاهش هم از لحاظ آماری معنی دار است ( P value≤0.04). لذا می توان گفت مصرف هم زمان چای سبز با رژیم غذایی پر کالری اثر کاهنده بر روند افزایش بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی دارد.

واژه گان کلیدی : آلفا آمیلاز، کبد، بیان ژن، چاقی،چای سبز

عنوان                                         فهرست مطالب                                           صفحه

چکیده:  1

فصل  اول:  کلیات   2

1-1- بیان مسئله. 3

1-2- اهداف پژوهش. 4

1-3- فرضیات اصلی پژوهش. 4

1-41- جنبه جديد بودن و نوآوري در تحقيق. 4

فصل  دوم:  مروری بر مطالعات گذشته   5

2-1-آمیلاز  6

2-1-1- تاریخچه. 6

2-1-2- آمیلاز در تکامل انسان. 6

2-1-3- کارکردهای آمیلاز. 7

2-1-4- ساختار آمیلاز. 9

2-1-5- اندازه گیری سطح خونی. 9

2-2- آلفا آمیلاز  10

2-2-1-کارکرد آلفاآمیلاز. 11

2-2-2- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان. 12

2-3- آمیلاز بزاقی یا Ptyalin  12

2-3-1- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی. 12

2-4- آلفا آمیلاز پانکراس  13

2-5- آلفا آمیلاز در پاتولوژی  13

2-5-1- تفسیر میزان آلفا آمیلاز. 13

2-6- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز  14

2-7- مطالعه فعالیت آنزیم  14

2-7-1- روشهای اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی  14

2-7-2 - روشهای رنگ سنجی :. 15

2-8- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain)  15

2-9- ژن های آلفا آمیلاز در انسان  16

2-10- آلفا آمیلاز در موش  18

2-10-1-تفاوت توالی انتهای 5 mRNA های آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی موش از لحاظ اندازه. 19

2-10-2- مطالعات مربوط به آنالیز توالی mRAN آلفا آمیلاز کبدی  20

2-10-3- خصوصیات  mRAN آلفا آمیلاز کبدی. 20

2-11- مهار کننده های آلفا آمیلاز  21

2-11-1- چای سبز. 22

2-11-2- فواید چای سبز. 22

2-11-2-1-جلوگیری از بیماری گرفتگی رگها. 23

2-11-2-2-تاثیر چای سبز روی افراد مبتلاء به تری گلیسیرید 24

2-11-2-3-رقیق شدن خون و جلوگیری از لخته شدن آن 24

2-11-2-4-کاهش فشار خون و جلوگیری از ابتلاء به آن 24

2-11-2-5-حداقل رساندن میزان صدمات وارد شده به مغز و قلب 25

2-11-2-6-حفاظت در مقابل انواع سرطان 25

2-11-2-7-جلوگیری از دیابت نوع 2 25

2-11-2-8-کاهش وزن 26

فصل سوم  مواد و روشها   27

3-1- روش های اجرایی کار :  28

3-1-1- حیوان آزمایشگاهی مورد مطالعه :. 28

3-1-1-1-دلایل انتخاب این حیوان به طور خلاصه عبارتند از :. 28

3-1-1-2-شرایط نگه داری حیوانات :. 28

3-1-2- نوع مطالعه  29

3-2- روش اجرای طرح (چاق کردن موش ها با استفاده از رژیم غذایی با چربی بالا)  29

3-2-1- تهیه عصاره ی آبی و الکلی چای سبز. 30

3-2-2- جدا سازی کبد و خونگیری از قلب موش. 30

3-3- استخراج RNA  34

3-3-1- وسايل کار استخراج  RNA. 34

3-3-2- مراحل استخراج    RNA.. 34

3-3-2-1-  رسوب دادن RNA :. 35

3-3-2-2-  شستشوي RNA :. 35

3-3-2-3-  خشك كردن رسوب RNA :. 35

3-3-3-  ارزيابي كمي و كيفي RNA استخراج شده:. 36

3-3-3-1-  اندازه گيري مقدار RNA :. 36

3-3-3-2- بررسي كيفي RNA :. 36

3-3-3-3-  حفظ و نگهداري RNA:. 37

3-4- بررسی بیان ژن  37

3-4-1-  RT-PCR. 37

3-4-2-  تکثیر cDNA. 39

3-4-2-1- PCR(Polymerase Chain Reaction) 39

3-4-2-2- مواد و وسايل مورد نياز برای ساخت  cDNA 43

3-4-2-3- روش انجام آزمايش ساخت  cDNA 44

3-4-2-4- نحوه انجام واكنش RT-PCR   برای اطمینان از صحت سنتز cDNA 45

3-4-2-5- آشکار سازی محصولات PCR با الکتروفورز 47

3-4-2-6- دستگاههای مورد نیاز برای الکتروفورز 47

3-4-2-7- مواد لازم برای الکتروفورز 47

3-4-2-8- نحوه انجام الکتروفورز 48

3-4-2-9- آشکار سازی ژل 48

3-5- Real time PCR. 49

3-5-1- موارد استفاده از Real-time PCR. 49

3-5-2- فازهاي مختلف يك واكنش Real time PCR. 50

3-5-3- روش‌های سنجش با Real-time PCR. 51

3-5-3-1- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR 51

3-5-4- مفهوم Threshold وCt. 52

3-5-5- نحوه  رسم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis). 53

3-5-6- نحوه انجام Real time PCR. 55

3-5-6-1- مواد لازم براي انجام  Real time PCR. 55

3-5-6-2-روش انجام آزمایش Real time PCR. 55

3-5-6-3- آنالیز آماری  . 57

3-6-اندازه گیری α-Amylase در سرم موش:  57

3-6-1- جداسازی سرم از خون موش. 57

3-6-2- اندازه گیری α-Amylase در سرم روش فتومتریک. 57

فصل چهارم  نتایج.. 60

4-1- مشاهدات افزایش وزن موش های گروه تست  61

4-2- تعیین کیفیت و غلظت RNA استخراج شده  66

4-3- بررسی کیفیت cDNA سنتز شده به وسیله PCR  67

4-4-آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis)  68

4-4-1- مقایسه بیان ژن liver alpha amylase در موش های چاق و نرمال. 70

4-4-2-اثر چاي سبز بر بیان ژن liver alpha amylase بر روي موش هاي چاق  71

4-5- اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک  72

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری   73

5-1- بحث و نتیجه گیری  74

5-2-پیشنهادات  81

منابع  83

خلاصه انگلیسی  92

عنوان                                       فهرست جداول                                          صفحه

جدول 3-1-رژیم غذایی پر چرب  29

جدول 3-2-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA  44

جدول 3-3-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتزcDNA  44

جدول 3-4-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA  45

جدول 3-5-توالی پرایمرها براي تکثیر قطعه مورد نظر داراي ژن آلفا آمیلاز کبدي  45

جدول 3-6 مواد لازم براي انجام واکنش RT PCR  46

جدول 3-7-مواد لازم براي Real time PCR. 55

جدول 3-8-پرایمرهاي مورد استفاده براي Real time PCR. 56

جدول 3-9-مقادیر لازم براي انجام تست سنجش آلفا آمیلاز  59

جدول 4-1-تغییرات وزن موش ها تحت رژیم غذایی متفاوت  61

جدول 4-2-میزان جذب نور توسط DNA  در طول موج هاي 260 و 280 نانومتر  67

عنوان                                        فهرست نمودارها                                          صفحه

نمودار 3-1-فازهاي مختلف واکنش تکثیر  51

نمودار 3-2-Cycle threshold&Threshold. 53

نمودار 3-3-منحنی ذوب  54

نمودار 3-4-مراحل مختلف انجام واکنش Real time PCR. 56

نمودار 4-1-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادي  64

نمودار 4-2-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادي  64

نمودار 4-3-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادي  65

نمودار 4-4-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادي  65

نمودار 4-5-منحنی تکثیرژن آلفا آمیلاز کبدي  69

نمودار 4-6-منحنی ذوب ژن آلفا آمیلاز کبدي  69

نمودار 4-7-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدي در موش هاي چاق عادي و کنترل عادي  70

نمودار 4-8-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدي در موش هاي چاق عادي و چاق کنترل  71

نمودار 4-9-تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق و نرمال بر حسب IU/ml به روش فتومتریك  72

عنوان                                       فهرست اشکال                                         صفحه

شکل2-1-نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است  11

شکل2-2-ساختار کریستالی آلفا آمیلاز جو ایزوآنزیم 1  16

شکل2-3-جایگاه ژن آمیلاز روی ژن 1p21  17

شکل2-4-این شکل تکامل ژن آمیلاز انسانی را نشان می دهد  19

شکل2-5-توالی اي که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین  mRAN آلفا آمیلاز کبدي و غدد بزاقی  20

شکل2-6-مقایسه شماتیکی از mRAN آلفا آمیلاز کبدي و بزاقی  21

شکل3-1-پلت آزمایشگاهی  30

شکل3-2-مراحل خونگیري از قلب موش  32

شکل3-3-مراحل جداسازي کبد موش  33

شکل3-4- غلظت مواد استفاده شده در Master mix استفاده شده در PCR  46

شکل3-5-اتصال SYBR به DNA  52

شکل4-1-تصویر باند حاصل از RNA استخراج شده  67

شکل4-2-صویر محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفی انتخاب شده بودند  68